即便新兴蛋白检测工具层出不穷，WB的地位依旧坚挺，但要做好却并不简单。如何避免各种高背景、非特异性、假阳性结果？你可以从实验设计必备对照——「内参」里找到答案。文末还有双十一「宠粉」活动！11.11~11.13日，精美礼品天天送，快来参与吧~

什么是内参？

内参是指一种高表达或广泛表达的蛋白，且在各组织和细胞中的表达相对恒定，可作为WB技术分析蛋白水平的标准化参考。

为什么要使用内参？

在WB开始之前，常使用生物化学测定法（例如Bradford，BCA等）测定样品中的蛋白总量，确保在各孔加入等量蛋白。内参可帮助确认所有样品是否都已上样，各个孔的电泳是否正常工作，内参信号的分析也可鉴别出蛋白在WB实验中转膜的均一性。

此外，大多数杂志要求WB结果中有内参数据，只有当各孔之间的内参蛋白表达量相当时，在目标蛋白上观察到的改变才被认为是可靠的。

如何归一化WB结果？

WB可用于蛋白半定量，需要将数据归一化（normalize）来比较多个样品目标蛋白的相对表达。具体方法如下：

通过灰度值分析测定每个蛋白的条带强度；

目标蛋白的条带强度除以内参的条带强度，以减少样品间变化的影响；

比较所有泳道上目标蛋白的相对表达量以评估样品中目标蛋白表达的变化。

WB归一化步骤（向左滑动查看全图）

选择内参抗体需要考虑的因素

?分子大小

内参蛋白分子大小（kDa）的选择非常重要，与目标蛋白相比，内参蛋白应该要足够大或足够小，以便与目标蛋白区分。如果目标蛋白和内参蛋白大小相当的话，WB结果无法直接观察，很难进行准确数据的分析。

?线性范围及上样量

线性范围是条带强度与膜上目标蛋白表达成比例的区域，过高或过低的上样量都会产生误差。很多情况下，目的蛋白的表达量相较于内参来说非常低，常常需要加大上样量，但是，这时内参表达量就会超出线性范围。超载的凝胶，在所有的泳道上表现出相同的条带强度，这种检测无疑是不准确的。

确定线性范围：比较每个样品的灰度值及线性响应信号，显示加样量在4.0ng以上达到饱和。因此，最佳加样量应≤4.0ng。

因此，推荐先确定样本的线性范围，可稀释样本来创建标准曲线。根据标准曲线来鉴定饱和点和所需的总蛋白量。

?表达强度及稳定性

确保选择的内参在样品中高表达。大多数常用的内参蛋白是由保守基因高表达的，这些保守基因是细胞发育及维持细胞活力所必须的（即看家基因）。

此外，还应该选择表达不受实验变量影响的内参。最佳的内参应当不受样本来源（如正常和疾病样本）、实验条件的影响。例如，GAPDH不适用于氧相关研究，因为缺氧可能上调GAPDH的表达。

图中的内参蛋白表达量受实验条件的影响，应更换合适的内参。

?常用的内参蛋白大小及使用注意事项请见如下表格：

WB中如何使用内参？

?简易标记法

只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可。

?Stripping和Reprobing

确定内参表达的常用方法是Stripping和Reprobing。先进行目的蛋白的抗体孵育显色和检测。然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，再用内参特异性抗体重新检测。

在Strip之后，为了确认完全的抗体去除，膜应洗涤、封闭，然后用二抗染色。如果Strip完成，二抗将不产生检测信号。如果检测到信号，则必须优化Strip条件。

Stripping和Reprobing操作步骤（向左滑动查看全图）

?剪膜实验

当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行检测。

剪膜操作步骤（向上滑动查看全图）

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?alphaTubulin(DM1A)Antibody

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